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發布時間:2018-10-10

液相色譜儀是屬于易學難用的儀器,特別講究“正確使用”和經驗。


液相工作者接触最多的是流动相,也就是流动相,是造成液相色譜儀各种问题的最主要源头。


液相色譜儀最常见的故障一是堵,二是漏。下面就这两点分别展开讨论。(注:流动相以甲醇为例,色谱柱以C18为例)


一.先聊聊“堵”的情況


“堵”的表現現象就是柱壓異常升高,直接原因就是流路不暢。堵塞的主要位置就是在色譜柱的前端,最主要原因就是流動相裏有雜質,雜質的主要來源就是細菌。


“堵”的原因之一:配制流動相時細菌汙染


首先,我們要認識到,一般的國産甲醇其實不需要額外過濾處理,直接使用沒有問題。即使是有些固態微粒雜質,也能在液相流路系統最前端的過濾頭上排除,真正容易引起問題的,是水中的細菌。


新制備的純水在室內放置幾天就會長菌,而這些細菌雖然肉眼不可見,卻足以堵塞柱填料顆粒的空隙,造成柱子很快報廢。這就是在配制流動相時造成的細菌汙染的原因,解決它的方法很簡單,就是確保水的可靠性。這裏有兩種方式推薦:


(1)最理想的方式當然是購買實驗室專用純水機,既方便又可靠,質量也放心。唯一的缺點就是價格不菲。


(2)成箱購買市售品牌純淨水,如,500mL一支的怡寶或娃哈哈,這些水的質量足以應付液相色譜的要求。先隨機抽取一支做一下細菌平板實驗,待菌落數合格方可使用。這樣每次只要單獨開一支即可,也很方便。每次成本2元左右。


※這裏特別指出一個細節:在絕大多數書本上,凡談到配制流動相都會談到最後有一個過濾的步驟。但是從我們長期使用的實際效果來說,只要能保證水的質量,這一步完全可以也應當去除。


原因有以下三點:


(1)流動相過濾在理論上有好處,但是,實際操作時由于不可能做到專瓶專用,反而容易造成的交叉汙染,對于配比複雜的流動相影響更大。


(2)流動相過濾在經濟成本上不劃算。買一套過濾裝置要6000多元,且過濾器公認是比較容易損壞的設備。最主要是過濾片的成本太高,一片就要幾十元。按一般液相柱的正常使用壽命計算,過濾片的成本會遠遠高于色譜柱的成本。
(3)流動相過濾對于工作效率成本不劃算。使用溶劑過濾器有一個預清洗、裝備、使用、用後清洗,晾幹的過程,至少也有一個小時的時間。這個成本也不能忽視。


(4)在實際工作未發現流動相不過濾會對柱壽命有任何影響。我們起碼有6年時間沒有做過流動相過濾的工作,但是和國內同行相比較,在同等使用強度下我們的柱壽命是比較長的。


“堵”的原因之二:使用流動相時的細菌汙染。


指的是:


流动相刚开始没有长菌,在使用时却产生了细菌污染。这主要是在使用多元液相色譜儀时的一种不良使用习惯造成的。
舉最簡單的例子:


50%的甲醇水流動相,有兩種使用方式。一種方式是在上機前就配好混合在一起,另一種方式是在流路A放純甲醇,流路B放純水。


從單純實驗效果來說,後一種有明顯的優點:首先是簡單,不需要實驗者另個計算配比混合,其次就是比例准確,能得到保留時間重複性極好的實驗效果。


但是,它有一個致命的缺陷,就是純水在流動相瓶中幾天時間就會長細菌(很多情況下不僅僅用純水作流動相,而是用緩沖鹽溶液,本身就是優質肥料,細菌長得更迅速),一旦有細菌柱子就壞得很快。所以這種方式要求操作人員每次實驗都要用新制備的純水,更要求在每次實驗後把水相換掉,換成甲醇沖洗幹淨,這一點在實際工作中很多人意識不強,就是意識到了但多次使用中總有一兩次會遺漏,但是往往這一兩次就足以産生致命的影響。因爲液相色譜柱的堵塞是不可逆的。


所以,甯可犧牲小小的保留時間的重複性,也不要用純水溶液作爲流動相的一組。從實際實驗效果來說,我建議用10%的甲醇水代替純水溶液(以前我做過不同比例甲醇水的細菌總數實驗,在5%就基本可以抑菌,在10%及以上就可以完全殺菌了),這樣可以有效排除長細菌的隱患,既可作流動相,也可沖柱。就算是在配制流動相時會計算得麻煩一些,但是一次麻煩,終身受益。


“堵”的原因之三:不適當操作。


常見問題的有以下几种:


(1)在更換零件時選擇的型號有誤,接口不是很匹配,在擰緊的時候産生變形而使得管路堵塞。
(2)樣品處理液淨化得不幹淨,長期會在六通閥和柱之間形成阻塞不暢。
(3)在使用手動六通閥時,有些人可能由于手勁小的原因,轉動的不到位,于是造成流路形成了死堵,壓力快速升高超過警戒值。
(4)在使用金屬管路作出廢液管時,應當注意最好廢液瓶中先放一些水,並把廢液管的出口端放在液面下。如果位于在液相上且實驗使用較高濃度的緩沖鹽溶液,在停機時可能在出口端結晶成塊並造成堵塞。這種情況不常見,但卻的確發生過。


“堵”的原因講了不少,現介紹查堵的方法。


在發生“堵”的現象後,就需要找出原因,主要是什麽位置發生了“堵”。注意,絕大多數情況下,整個系統只會有一個地方發生堵塞。


查堵的方法是從尾向前逆向分段拆開,仔細觀察壓力數值,如果某一個部件(柱子除外)裝上和拆下時的壓力差別很大,可發展變化判斷。至于柱的堵塞,可以通過換同樣規格的柱的壓力是否一致來判斷。


下面再談一下“漏”的問題。“漏”分兩種:漏液和漏氣。


一、漏液


液相色譜儀从流动相瓶到废液瓶之间的流路是一个全封闭体系,内部压力很高,但外部却能保证一滴不漏。如果某个部件发生了漏液,那就是故障所在。
漏液的原因分兩種:


(1)接觸硬件不當


在更換零件如流路管或換柱時,換的接頭接口不匹配,造成漏液。要注意不同公司的柱子接頭很多是不同的,甚至同一家公司在不同時期生産的液相柱接頭也有很大區別。當然選用PEEK接頭是一個較好的解決方法,不僅通用性好,而且靠手擰就能保證不漏液。


即使是接口本身是匹配的,但是如果操作不當也會漏液,一種不當就是力度把握不好,擰得太緊或太松;另一種不當就是致命的錯誤:滑絲,這是往往是動手能力不太強,螺絲釘很少擰的工作者犯的錯誤,滑絲的後果不僅是漏液那麽簡單,常造成重要部件的報廢。解決這個問題只能靠惡補基本功來實驗,那就是擰螺絲。


(2)使用儀器不當


如果是輸送泵漏液,最常見的原因就是在活塞位置緩沖鹽析出造成。
析出的原因有兩個,一是使用緩沖鹽溶液時突然加入了純甲醇而析出,這種錯誤很容易避免,這是盡量不要用純的甲醇和純水。只要互相有10%的比例就不會出現這個問題。另一原因是在用緩沖鹽溶液(不論甲醇含量有多少)作流動相時,實驗結束後沒有換甲醇水沖洗,使得微滲的流動相幹燥形成晶體造成。
不過,輸送泵漏液並不是非得馬上修不可,沖洗幹淨並在以後的使用中多加小心一般都可以正常使用。


檢測器漏液是個很麻煩的事,一般都是吸收池的問題,更換的費用相當高。但是並不是說一定要馬上更換,還可以從實際實驗效果看能否湊合使用。




二.漏氣


漏液是从内部向外漏,而漏气则是外部的气体进入液相色譜儀的流路内部形成了气泡。下面按流路的方向逐个部件分析产生气泡的原因和相应解决方法。


1.過濾頭


抽液時,在流路管中有不規則但持續的小氣泡産生,這時考慮的是流動相有沒有脫氣(需要特別提醒即使是有了真空脫氣機也是要先超聲脫氣的,起碼可以減少脫氣機的工作壓力並提高工作效率),如果已經脫了氣,則要注意過濾頭的汙染也會造成這種現象。處理方法比較簡單,擰下過濾頭在稀硝酸中浸泡,超聲半小時,洗淨後裝回去即可。


2.透明流路管


指的是在过滤头和输送泵之间的那一段管路。这一个部分往往不是有点气泡,而经常是整个管中全是空气而操作人员却浑然不知,以致输送泵工作了半天才发现流动相瓶里的液体一点也没少。这也是我们常说的液相色譜儀至少一周要开机一次的原因(我们做液相一定要有“微渗”的概念)。如果长时间不用,这一段管路的液体会彻底干掉,而充满空气的管路和充满液体的管路不仔细看是分辨不出的。


這種情況對于輸送泵很危險,因爲,泵從設計來說是輸送液體而不是氣體,內部的液體對于活塞來說起到了機油的作用,如果活塞杆上還殘存了一些緩沖鹽,則極易拉傷,造成不可逆轉的影響。


对于这种情况,要突出“预防为主”,如,液相色谱使用人员要相对固定和稳定,工作中合理搭配资源,每台机一周击至少作一次实验,如长期不用起码每周要冲流动相2 小时。养成良好的工作习惯很重要。


如果不慎出現了這種問題怎麽辦?我的建議是用外力使管路中充滿液體。具體如下:


(1)找到流路管進入輸送泵的接頭。
(2)擰下來。
(3)用一幹淨的洗耳球的尖端對准管路的平整切口。
(4)吸液体,看液面从流动相瓶里上升,至离洗耳球5 厘米左右时停止该动作。
(5)快速把接頭擰回輸送泵上(這個過程可能會有少許流動相外泄,這是正常現象)。
(6)開機,打開排液閥門,啓動輸送泵。
(7)等排液管中流出的溶液沒有氣泡時,再關閉排液閥,儀器正常工作。
3.輸送泵和柱子
這些部分進了氣泡一般不怕,沖掉就行。


4.檢測器


應該說,整個流路中只要有一個氣泡都會在檢測器上得到強烈的信號反映,檢測器內部的氣泡一般都能被沖走,但也有很難沖掉的殘留氣泡的情況。


如果檢測器裏有殘留氣泡,會有特征明顯的表現形式,就是在走基線時會時不時間隔出現直上直下信號很大的信號峰。這時先看普通流量能否沖走,如果沖不走,那唯一的辦法就是拆柱,把檢測器直接連到輸送泵的出口,加大幾倍流量沖洗,則肯定能沖走氣泡。


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